在競爭日益激烈的制藥行業(yè)，按照法規(guī)、指南等傳統(tǒng)模式進(jìn)行生物分析，已經(jīng)無法適應(yīng)不斷增長的資源、時間、生產(chǎn)效率和加速決策的需求。通過一個分級驗證適合其用途的PK LBA方法的方式，可以在生物藥開發(fā)的早期階段做出科學(xué)合理的決策，從而提高新藥開發(fā)的效率。
本文將著重介紹并描述PK LBA方法中校準(zhǔn)曲線的設(shè)計、生成、編輯以及擬合模型和權(quán)重選擇的相關(guān)思考和建議。由于篇幅有限，本文將采用上下篇的形式來展開論述，敬請垂注！
1.導(dǎo)論
校準(zhǔn)曲線（Calibration curve）代表了檢測到的響應(yīng)變量與標(biāo)準(zhǔn)參照（比）物（reference standard）濃度之間的關(guān)系，這個關(guān)系假定了該標(biāo)準(zhǔn)參照物能夠代表真實測試樣本中的目標(biāo)分析物（analyte of interest）或待測物。
校準(zhǔn)曲線用于通過插值計算定量地測定樣本中未知濃度的待測物。校準(zhǔn)曲線的產(chǎn)生，是通過將待測物加入被判斷為能真實地代表樣本的基質(zhì)中而形成校準(zhǔn)品，隨后依照未知樣本和質(zhì)量控制樣品（QC）的儀器讀出值，然后根據(jù)校準(zhǔn)（或標(biāo)準(zhǔn)）曲線進(jìn)行內(nèi)插從而計算未知樣本的濃度。
為了優(yōu)化擬合非線性校準(zhǔn)曲線，應(yīng)當(dāng)考慮三個因素：
（1）擬合平均濃度與響應(yīng)的關(guān)系；
(2)對非線性劑量-響應(yīng)曲線中的已知差異率（heteroscedasticity/non-constant response-error relationship，非恒定的響應(yīng)-誤差關(guān)系）使用適當(dāng)?shù)臋?quán)重；
(3)使用適當(dāng)?shù)那€擬合算法來估算擬合的參數(shù)。
對樣本定量的準(zhǔn)確度取決于該分析方法的校準(zhǔn)曲線的穩(wěn)健性和可重復(fù)性，該分析方法反過來又取決于參照（比）物（reference material）和其他測試組分（assay component）的性能。應(yīng)該在方法開發(fā)階段中徹底評估配體結(jié)合式測試（LBA）方法的組成成分（即試劑）的性能特性，這些包括但不限于固體或固定的表面（如96孔板）和捕獲/檢測抗體。同時，應(yīng)當(dāng)制定適當(dāng)?shù)挠媱?，以監(jiān)控批次間相關(guān)試劑的一致性。
此外，相關(guān)法規(guī)指導(dǎo)文件和該領(lǐng)域?qū)＜野l(fā)表的指導(dǎo)性文件中定義了設(shè)計校準(zhǔn)曲線的一般要求、校準(zhǔn)樣品的驗收標(biāo)準(zhǔn)以及如何選擇適當(dāng)?shù)幕貧w模型。遵守這些已發(fā)布的準(zhǔn)則和要求可提高校準(zhǔn)曲線的可重復(fù)性（跨運行和跨研究）。
總之，每個生物分析實驗室都有責(zé)任在其標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOPs）中定義LBA校準(zhǔn)曲線的設(shè)計、產(chǎn)生、驗收和編輯標(biāo)準(zhǔn)。本文旨在為產(chǎn)生校準(zhǔn)曲線以及處理校準(zhǔn)品數(shù)據(jù)點提供建議和最佳做法。雖然本文的內(nèi)容也可能適用于某些生物標(biāo)志物的檢測方法，但其重點仍然是用于定量藥代動力學(xué)(PK)的LBAs的校準(zhǔn)曲線。其他所有的測試類型或格式都暫不討論。
LBAs和色譜分析方法的校準(zhǔn)曲線之間存在著關(guān)鍵區(qū)別。在LBAs中，儀器響應(yīng)可能與待測物的濃度呈正比關(guān)系（directly），也可能與待測物濃度呈反比關(guān)系（inversely），這取決于該分析方法是非競爭性還是競爭式的。無論采用何種格式，可以使用半對數(shù)坐標(biāo)系（semi-log scale）將曲線轉(zhuǎn)換成響應(yīng)與待測物濃度之間的S型關(guān)系。這與色譜分析方法不同，在色譜分析中，儀器響應(yīng)通常是濃度的線性函數(shù)，兩者在大多數(shù)校準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)是呈成正比例關(guān)系的。對于色譜法來說，線性關(guān)系的喪失表明該方法已經(jīng)達(dá)到了它的檢測極限。
LBAs方法依賴于待測物與結(jié)合試劑（如抗體或受體部分）的相互作用，而這與傳統(tǒng)的色譜分析不同，在傳統(tǒng)的色譜分析中，待測物的檢測不依賴于其與某個大分子的結(jié)合（binding）。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的動態(tài)平衡性質(zhì)導(dǎo)致了LBAs的非線性響應(yīng)。此外，由于LBAs的效能在很大程度上取決于其所使用的生物試劑的性能，因此其檢測結(jié)果往往表現(xiàn)出較大的變異性（variance）。
非線性的LBA校準(zhǔn)曲線限制了曲線上端和下端的濃度-響應(yīng)的相關(guān)性，使得曲線處于平臺狀態(tài)，因此形成S型曲線。在典型的sigmoidal校準(zhǔn)曲線中，下部平臺（漸近線asymptote）及其附近代表了背景響應(yīng)，上部平臺代表接近最大響應(yīng)。通常認(rèn)為4PL模型是擬合此形狀校準(zhǔn)曲線的首選。另外，在校準(zhǔn)曲線的漸近線(上、下平臺部分)上進(jìn)行定量將導(dǎo)致產(chǎn)生較差的精密度和準(zhǔn)確度。這些特性最終縮小了LBA方法的有效定量范圍，使得選擇合適的非線性數(shù)據(jù)擬合算法變得更加重要。
有多種商業(yè)軟件可用來執(zhí)行LBAs的非線性回歸。大多數(shù)分析儀器制造商均有提供與設(shè)備兼容的非線性回歸軟件。實驗室可選擇安裝獨立軟件或使用其實驗室信息管理系統(tǒng)(LIMS)來進(jìn)行回歸擬合，具體取決于哪種軟件更能滿足其需要和要求。
用于擬合LBA校準(zhǔn)曲線的軟件應(yīng)該具有使用4個和5個參數(shù)logistic模型（Four and five parameter logistic regression，4和5 PL）進(jìn)行回歸分析的能力，并且能夠：
當(dāng)前，一些生物分析指南或法規(guī)文件的生物分析部分已經(jīng)對校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低要求進(jìn)行了確定。這些指導(dǎo)性文件對LBA曲線的需求和性能預(yù)期通常是相互一致的。表1總結(jié)了來自美國食品和藥物管理局(FDA)、歐洲藥品管理局(EMA)、日本衛(wèi)生、勞動和福利部(MHLW)和巴西衛(wèi)生監(jiān)管機構(gòu)(ANVISA)對校準(zhǔn)曲線的要求。FDA和EMA指南是絕大多數(shù)生物分析實驗室遵從的主要指南。各個制藥廠商應(yīng)根據(jù)各自計劃所提交的新藥審核監(jiān)管機構(gòu)來決定自身需要遵從的指南法規(guī)。
校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品（Calibrator standards）是通過將已知濃度的參照（比）藥物加入到與研究樣本基質(zhì)相同或一致的，經(jīng)過認(rèn)證的基質(zhì)（matrix）中而產(chǎn)生的。這些校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度——響應(yīng)關(guān)系則確定了該測試方法的校準(zhǔn)曲線。在涉及多種藥物聯(lián)合使用的研究中，研究樣本中的每個待測物都需要一條校準(zhǔn)曲線。校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品的制備必須獨立于質(zhì)量控制樣品（QCs），以避免潛在的藥物加入造成誤差的擴散或放大。
這意味著校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品和QCs可能不能使用相同中間庫存的藥物參照（比）品來制備，但可以通過連續(xù)稀釋藥物參照（比）品的初級或中級庫存來制備校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品。制備校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品不需要在每個濃度水平上單獨外加藥物參照（比）品來制備，盡管這種做法意味著需在更高一級的水平上對校準(zhǔn)曲線的質(zhì)量控制，并可以監(jiān)測外加藥物參照（比）品的精確度。無論藥物參照（比）品的中間庫存組成如何，校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)包含至少95%的研究樣本基質(zhì)。
使用LBAs方法的期望是在可能的情況下，盡一切努力在生物基質(zhì)中制備校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品，該生物基質(zhì)在物種、組成成份和基質(zhì)預(yù)處理等方面必須與研究樣本的基質(zhì)相匹配。例如，若研究樣本是未經(jīng)過濾的血清，那么制備校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品的基質(zhì)也必須是來自相同物種的未經(jīng)過濾的血清。需要注意的是，研究人群通常是伴有相關(guān)的疾病，而校準(zhǔn)品基質(zhì)（calibrator matrix）則是來自于健康的受試者。如果沒有其他對待測物做定量分析的方法，那么用替代基質(zhì)來制備校準(zhǔn)品也是合理的，例如當(dāng)研究使用的基質(zhì)稀缺或很難獲得時,當(dāng)研究藥物有內(nèi)源性同源物時,在對生物標(biāo)志物進(jìn)行檢測時等。
當(dāng)使用替代基質(zhì)來制備校準(zhǔn)品時，該生物分析方法應(yīng)該使用研究樣本基質(zhì)制備的QCs和研究基質(zhì)選擇性樣本（study matrix selectivity sample）進(jìn)行驗證，并與替代基質(zhì)中制備的校準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較和評估。除此之外，還建議分析者進(jìn)行其他試驗，以證明替代基質(zhì)與研究基質(zhì)的稀釋曲線兩者之間的可比性。一種普遍接受的方法是測試上下漸近線、增長率（growth rate）以及5PL曲線中不對稱因子的等同性。當(dāng)前業(yè)界內(nèi)已提出如何測試平行性（parallelism）的方法，平行性測試是一個評估LBA方法相對準(zhǔn)確性的基本實驗。通過分析稀釋對基質(zhì)中內(nèi)源性待測物定量的影響，可以在單個實驗中評估該測試方法的選擇性、基質(zhì)效應(yīng)、所需的最小稀釋率、健康和患病人群的內(nèi)源性待測物的水平以及LLOQ。
這些等效性測試的接受標(biāo)準(zhǔn)尚未確定，但已在業(yè)界廣泛討論。圖1提供了在人血漿中制備的校準(zhǔn)曲線的示例，同時也提供了在緩沖液（替代基質(zhì)）中制備的校準(zhǔn)曲線。它們是兩條平行的曲線。
校準(zhǔn)樣品可用100%或以最低稀釋度(minimum required dilution，MRD)稀釋后的基質(zhì)配制。使用MRD稀釋基質(zhì)的方法的例子包括但不限于罕見基質(zhì)或在自動化平臺上執(zhí)行的方法，在這些平臺上使用100%基質(zhì)可能會由于有限的可及性（limited availability）或由于基質(zhì)的粘度而成為問題。在方法開發(fā)過程中，應(yīng)根據(jù)測試方法性能來決定校準(zhǔn)樣品是用100%的基質(zhì)還是用MRD稀釋的基質(zhì)制備，應(yīng)根據(jù)具體的實際情況進(jìn)行適當(dāng)?shù)脑u估，以確保校準(zhǔn)樣品和QC的回收率在理論值的預(yù)期范圍內(nèi)（例如，±20%）。當(dāng)在100%基質(zhì)中制備時，校準(zhǔn)樣品需要以用于QCs和研究樣本相同的MRD來稀釋。未知樣品回算的濃度應(yīng)報告為100%基質(zhì)中的濃度。
在生物分析應(yīng)用中，選擇認(rèn)證后的混合基質(zhì)（qualified matrix pool，QMP）的過程至關(guān)重要。建議認(rèn)證和儲存足夠的混合基質(zhì)，確保足以用來完成方法開發(fā)、驗證和至少第一次研究中樣本分析。還建議將QMP儲存在與QCs和研究樣本相同的條件下。例如，如果樣本的儲存溫度小于或等于-65℃，則QMP也應(yīng)儲存在該溫度范圍內(nèi)。
在方法開發(fā)過程中，可以篩查、選擇和合并單個基質(zhì)樣本或單個混合基質(zhì)來生成QMP，商業(yè)來源的混合基質(zhì)也可能適用。QMP篩查應(yīng)包括評估對未外加和外加了待測物的基質(zhì)樣品的檢測信號。例如，出于篩查的目的，可以在單個基質(zhì)樣本加入相當(dāng)于LLOQ水平的待測物。具有高背景或加標(biāo)回收率不合格的基質(zhì)樣品應(yīng)排除在QMP之外?；|(zhì)樣品的驗收標(biāo)準(zhǔn)的一個實例可以是：使用QMP制備的校準(zhǔn)曲線，至少有80%的所有單個基質(zhì)樣品的加標(biāo)回收率在理論濃度的80%至120%之間。QMP應(yīng)該能代表研究人群，通過混合滿足接受標(biāo)準(zhǔn)的個體基質(zhì)樣本來制備。
LBA校準(zhǔn)樣品可以是新鮮制備的或者冷凍的。不少實驗室在所有階段習(xí)慣使用新制備的校準(zhǔn)樣品，包括方法開發(fā)、研究前驗證和隨后的生物分析。新鮮的校準(zhǔn)樣品可以從原始或中間參考標(biāo)準(zhǔn)的庫存（original or intermediate reference standard stock）中調(diào)取。如果使用中間參考標(biāo)準(zhǔn)，必須在發(fā)布驗證報告之前確定其穩(wěn)定性。在研究前的方法驗證中，使用新制備的校準(zhǔn)樣品來評估冷凍的QCs，可以初步建立QCs的穩(wěn)定性。
一旦初步確立了QC的穩(wěn)定性，實驗室就可以利用這些信息來制備和儲/凍存單個校準(zhǔn)樣品。如果將LLOQ和ULOQ樣品包含在穩(wěn)定性測試中，且穩(wěn)定性測試窗口覆蓋了校準(zhǔn)樣品的存儲期，則此方法就是可以接受的。預(yù)先認(rèn)證和凍存校準(zhǔn)樣品的目的是減少測試運行之間的變異性和提高操作效率。凍存的校準(zhǔn)樣品應(yīng)分裝在足夠一次性使用的容器中，并應(yīng)避免校準(zhǔn)樣品的反復(fù)融凍。
監(jiān)管機構(gòu)為校準(zhǔn)曲線的設(shè)計提供了指南。以下是指南準(zhǔn)則的簡短總結(jié):
ULOQ和LLOQ分別代表定量分析范圍的上限和下限，必須作為研究前驗證的一部分進(jìn)行驗證。為了驗證LLOQ和ULOQ校準(zhǔn)樣品，僅僅在這些級別上包括校準(zhǔn)樣品是不夠的，還需要在LLOQ和ULOQ水平上制備驗證樣品(QCs)，這些QCs必須包括在研究前驗證的準(zhǔn)確度和精密度的評估中。ULOQ校準(zhǔn)樣品必須分別滿足相對誤差(RE)為±20%和變異系數(shù)(CV)為≤20%的接受標(biāo)準(zhǔn)；LLOQ校準(zhǔn)樣品則必須分別滿足FDA指南中規(guī)定的±25%的RE和≤25%的CV，才能被納入校準(zhǔn)曲線。一旦經(jīng)過驗證，LLOQ和ULOQ水平校準(zhǔn)樣品將成為校準(zhǔn)曲線的一個組成部分，并且必須包括在每次測試運行中。
研究中每個待測物在每次分析測試運行應(yīng)當(dāng)有一條校準(zhǔn)曲線，校準(zhǔn)范圍必須適合并符合研究樣品中待測物的預(yù)期濃度范圍。一般來說，寬大的定量范圍有助于一次性地定量分析含有大范圍待測物濃度的大量樣本。狹窄的定量范圍則限制了該測試方法的分析能力，導(dǎo)致不必要的重復(fù)分析，即需要額外稀釋從而使樣本濃度進(jìn)入校準(zhǔn)曲線范圍。雖然將待測物濃度為零的校準(zhǔn)樣品定義為不含待測物的基質(zhì)樣品不是必須的，但可能是有益的。
目前的建議是對LBA校準(zhǔn)樣品進(jìn)行重復(fù)（duplicate）分析，盡管變化趨勢如高CVs，可能需要進(jìn)行三次（triplicate）復(fù)測。只有在該方法的量化范圍內(nèi)證明了原始響應(yīng)的穩(wěn)健性和高精密度的情況下，才能認(rèn)為使用單次測量（單孔singlicate）是合理的。
2012年EMA生物分析指南中討論了非線性回歸擬合時錨定點的作用，并在整個行業(yè)中推薦使用錨定點。錨定點被定義為在測試方法的定量范圍之上和之下的校準(zhǔn)樣品，但它們不受與校準(zhǔn)曲線點相同的性能要求的約束。錨定點的價值和在回歸分析時使用錨定點并不是被普遍接受的，但是建議將它們作為方法開發(fā)過程的一部分，并評估它們對改善整體回歸分析的作用。
使用錨定點是否能改善曲線擬合，應(yīng)基于所提出的數(shù)學(xué)算法或加權(quán)因子，并應(yīng)在個案基礎(chǔ)上確定。錨定點可能特別有助于增強曲線擬合，不僅在過度寬大或狹窄的校準(zhǔn)曲線的情況下，而且在使用加權(quán)因子的校準(zhǔn)模型中也是如此。在某些情況下，位于LLOQ以下的錨定點增強了曲線的擬合，并有助于LLOQ滿足其接受標(biāo)準(zhǔn)。
目前監(jiān)管機構(gòu)尚未就校準(zhǔn)樣品之間的間距和ULOQ/LLOQ信號比作出明文指導(dǎo)。一般推薦使用相等的校準(zhǔn)樣品的間距，如采用對數(shù)刻度（例如，on a logarithmic scale of the power of 2），這有利于改善測試方法的性能。
校準(zhǔn)樣品濃度的選擇部分是基于以下的實際考慮：即在進(jìn)行多個測試運行時，易于制備和無差錯地復(fù)制校準(zhǔn)品濃度。建議分析者使用系列稀釋（serial dilution）的方法，并使用一個固定的稀釋比例（使用與被分析的實際樣本相同的基質(zhì)稀釋校準(zhǔn)品）。最終結(jié)果是，校準(zhǔn)品在濃度范圍的對數(shù)刻度上的間隔大致均勻/相等的。在這些條件下，Rocke和Jones確定了校準(zhǔn)品的最佳稀釋比例，該比例通常為2：1或3：1。2：1的系列稀釋與6個校準(zhǔn)品濃度將產(chǎn)生一系列如1X，2X，4X，8X，16X，32X（稀釋倍比為2n: n = 0,1,2,3,4,5的曲線）。對于典型的響應(yīng)遞減曲線（D<A），Rocke和Jones的研究也顯示，如果使用最佳間距，校準(zhǔn)品濃度曲線的中點應(yīng)略高于預(yù)期的IC50濃度（當(dāng)LBA用于活性測定時）。這意味著在曲線較小方差（variance）的區(qū)域有更多的校準(zhǔn)點。對于上述2：1的稀釋比例，應(yīng)調(diào)整X，以便所預(yù)期的IC50 濃度位于8X稀釋的校準(zhǔn)濃度點附近?？梢蕴砑宇~外的校準(zhǔn)樣品（如果已包括在回歸模型的評估中）來更好地定義校準(zhǔn)曲線的拐點（inflection point）。
在LLOQ附近加入更緊密相鄰的校準(zhǔn)樣品可能有助于在LLOQ失效時，將靈敏度的損失降到最低。在校準(zhǔn)曲線中包含零濃度的校準(zhǔn)樣品不是監(jiān)管機構(gòu)的要求或標(biāo)準(zhǔn)做法，然而，如果一個實驗室選擇將零作為校準(zhǔn)曲線擬合的一部分，則建議在LLOQ和零校準(zhǔn)樣品之間留有足夠的間距，以保護(hù)LLOQ不會失敗。例如，2012年的EMA指南規(guī)定LLOQ的信號至少是空白樣本信號的5倍。每個實驗室應(yīng)根據(jù)測試方法的效能（performance）為其確定適當(dāng)?shù)拈g距。
ULOQ/LLOQ濃度比受測試格式（format）、平臺（platform）和試劑特性的影響。實驗室的目標(biāo)應(yīng)該是最大限度地提高ULOQ/LLOQ濃度比，并可設(shè)定其最低目標(biāo)，如10/1。
選擇一個合適的非線性回歸模型需要經(jīng)過多次迭代才能獲得LBA校準(zhǔn)曲線的最佳擬合。目前的監(jiān)管指南是建議使用能夠獲得足夠擬合度的最簡單模型來進(jìn)行擬合，建議在評估任何可能的權(quán)重之前，首先選擇回歸模型。評估權(quán)重能否減輕不同濃度下測試響應(yīng)不等同的變異性也很重要。
此外，還需要考慮的一個關(guān)鍵參數(shù)是可報告的測試結(jié)果的質(zhì)量，對它的考慮應(yīng)該超越對模型擬合質(zhì)量的考慮，并且可以通過準(zhǔn)確度進(jìn)行評估。因為準(zhǔn)確度概要（Accuracy profile）有助于各種擬合模型的可視化。必須強調(diào)的是，目前的研究文獻(xiàn)不鼓勵如下操作：（1）使用線性函數(shù)來近似S形曲線；（2）對數(shù)據(jù)進(jìn)行對數(shù)-對數(shù)轉(zhuǎn)換（log-log transformation）來使得固有的非線性關(guān)系近似于線性。
校準(zhǔn)曲線常用的非線性模型是4PL和5PL，可以通過許多自動化軟件實現(xiàn)擬合。雖然可以使用其他的非線性模型，但須謹(jǐn)慎且應(yīng)對4PL和5PL模型不適用的特殊情況加以證明。
4PL模型最常見的參數(shù)化形式是：
其中yj是對應(yīng)濃度xj的響應(yīng)，a為上漸近線，d為下漸近線，c為曲線拐點處的濃度，b為生長因子。該模型的一個特點是拐點附近的對稱性，而拐點對應(yīng)于d和a之間距離的一半。這個模型雖然也可應(yīng)用，但它通常產(chǎn)生的是一個不對稱的校準(zhǔn)曲線，因而需要使用5PL模型擬合。
5PL模型的一般參數(shù)化形式是：
其中g(shù)是不對稱因子。當(dāng)g=1時，5PL函數(shù)與4PL函數(shù)完全等價。圖2說明了4PL和5PL曲線之間的差異。
LBA校準(zhǔn)曲線擬合的另一個常見挑戰(zhàn)是不同校準(zhǔn)樣品濃度下響應(yīng)的不相等變異性（unequal variability），即響應(yīng)的噪聲（variance）通常不是恒定的，而是隨著響應(yīng)而變化，這種現(xiàn)象被稱為異方差性（heteroscedasticity），可以通過對模型進(jìn)行加權(quán)處理，使其與濃度范圍內(nèi)響應(yīng)的可變性成比例。如果應(yīng)對異方差性得當(dāng)，校準(zhǔn)曲線擬合的質(zhì)量則可以提高。應(yīng)對的基本思想是在表現(xiàn)出較高變異的響應(yīng)上減少其"權(quán)重"。換句話說，校準(zhǔn)曲線與低變異數(shù)據(jù)更緊密地擬合，并允許稍微偏離較高變異的數(shù)據(jù)，以這種方式加權(quán)可得到更寬泛的定量范圍，并在該范圍內(nèi)提高準(zhǔn)確度和精密度。如果不使用適當(dāng)?shù)臋?quán)重，將會導(dǎo)致LLOQ和ULOQ附近的插值有更大的偏差（bias）和不精密度（imprecision）。適當(dāng)使用權(quán)重可以減少重復(fù)測試的響應(yīng)值中的不相等方差（unequal variance）。
大多數(shù)軟件都具有執(zhí)行加權(quán)回歸所需的功能。軟件通常會選擇常用的權(quán)重，如1/Y和1/Y2，并通過評估響應(yīng)-誤差關(guān)系（response-error relation）來選擇最佳的權(quán)重函數(shù)。1/Y的權(quán)重增強了曲線底部的點，1/Y2的權(quán)重增強了曲線頂部和底部的點。還有其他權(quán)重因子和加權(quán)方法也同樣可以使用，并可能能夠更好地滿足特定測試方法的需求。
雖然曲線的非對稱性和異方差性（heteroscedasticity）是曲線擬合的重要考慮因素，但如果沒有適當(dāng)?shù)念A(yù)評估，將它們包含在模型中可能會導(dǎo)致擬合一個過于復(fù)雜的模型。在校準(zhǔn)曲線中包含反映測試方法自然變化的參數(shù)可能會導(dǎo)致回算誤差和增加所報告的結(jié)果的偏差（bias）。
做回歸分析時，有許多不同的方法可用于統(tǒng)計評估模型擬合的質(zhì)量。（包括R2和均方誤差（root mean square error）。但這些參數(shù)并非適用于所有情況，它們的設(shè)計目的是將響應(yīng)的誤差最小化，而不是將所報告的結(jié)果的誤差最小化。此外，Anscombe’s quartet表明，高度不同的數(shù)據(jù)可以獲得相似的擬合質(zhì)量，但并不能保證反向預(yù)測的相似。準(zhǔn)確度曲線（accuracy profile）是一種基于未來可報告結(jié)果的替代性圖形方法，它將各濃度水平下測試所得的可報告結(jié)果與真實值之間相對差異的b-期望容差區(qū)間（b-expectation tolerance interval）聯(lián)系起來。
b-期望容差區(qū)間被定義為某個比例(b%)的未來結(jié)果預(yù)期會下降的區(qū)間。該工具可以方便地可視化偏差、精密度和定量限（limit of quantitation，LOQ/定量限，在這里準(zhǔn)確度超出了可接受的范圍），提供了一種可以用來比較多個模型的簡單方法，并方便從中選擇精度最高的可報告結(jié)果的模型。
圖4給出了兩條不同的校準(zhǔn)曲線及其基于15%相對誤差的相關(guān)準(zhǔn)確度曲線（RE，定義為實驗值和理論值之間的差值與理論值之比）的接受極限（acceptance limit）。15%相對誤差的接受極限是指南推薦的。
至少有75%的校準(zhǔn)樣品，包括LLOQ和ULOQ校準(zhǔn)樣品，按回算濃度，必須通過接受標(biāo)準(zhǔn)：即該回算濃度在理論濃度的±20%(低定量限為±25%)的范圍內(nèi)，而CVs低于20%（在低定量限為<<>25%）(另見表1)。對于每個校準(zhǔn)樣品，應(yīng)該報告回算濃度的CVs，而不是儀器響應(yīng)的CVs。首先，應(yīng)該根據(jù)精密度排除校準(zhǔn)樣品。每次排除后，應(yīng)重新對曲線進(jìn)行回歸分析和評價。其次，應(yīng)該一次只排除一個校準(zhǔn)樣品，并且按偏差大小的順序，從擁有最高偏差（RE）的校準(zhǔn)樣品開始。另外，只有在需要時才排除其他校準(zhǔn)樣品。
屏蔽（masking）被定義為：在標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸時不使用某個校準(zhǔn)點，而該校準(zhǔn)點的數(shù)值仍存在于系統(tǒng)中。在討論曲線編輯時，屏蔽和排除（exclusion）這兩個術(shù)語可以互換使用。每個A校準(zhǔn)點通常是在微孔板的兩個孔（復(fù)孔）中進(jìn)行重復(fù)（duplicate）測試。如果曲線擬合是基于復(fù)孔測試的平均值，則只有當(dāng)兩個孔的測試結(jié)果都滿足接受標(biāo)準(zhǔn)時，才能接受該校準(zhǔn)點。在這種情況下，不建議排除一個孔的數(shù)值，而只使用另一個孔的結(jié)果。在某些試平臺，如Singulex，每個校準(zhǔn)點可能測試三次，在這種情況下，三個孔中至少有兩個必須通過，才能接受該校準(zhǔn)點。
如果LLOQ和ULOQ校準(zhǔn)點的所有重復(fù)測試都失敗，那么該驗證運行就失敗了，應(yīng)該調(diào)查失敗的可能原因（EMA 2012）。編輯校準(zhǔn)曲線只能在可以確定失敗原因的情況下進(jìn)行，例如：記錄在案的外加藥物誤差，或移液器誤差，或使用了先驗的統(tǒng)計標(biāo)準(zhǔn)。校準(zhǔn)曲線的編輯必須獨立于QC的評估， 這意味著，不能排除校準(zhǔn)點以方便QC的通過，除非不符合與校準(zhǔn)樣品相關(guān)的接受標(biāo)準(zhǔn)。每個實驗室必須在其標(biāo)準(zhǔn)操作程序中定義如何屏蔽和編輯校準(zhǔn)點。
屏蔽和排除校準(zhǔn)樣品的一般準(zhǔn)則如下:
一旦測試運行通過，每個樣本都可以根據(jù)校準(zhǔn)曲線進(jìn)行評估。如果一個未知樣本結(jié)果的CV%可接受，并且平均濃度落在該方法的定量范圍內(nèi)，則該結(jié)果可以被報告。如果樣本的平均濃度超出了定量范圍，則應(yīng)在適當(dāng)?shù)南♂尯笾匦聹y試該樣本，以獲得在定量范圍內(nèi)的結(jié)果。如果一個測試結(jié)果在定量范圍內(nèi)，而另一個復(fù)測結(jié)果低于LLOQ或高于ULOQ，則應(yīng)該報告平均值，前提是平均值在經(jīng)過驗證的定量范圍內(nèi)，且CV%是可接受的。樣本濃度結(jié)果應(yīng)報告為100%的基質(zhì)，在考慮了測試方法的MRD和任何其它稀釋的倍數(shù)之后。
正如在前一節(jié)中提到的，如果LLOQ校準(zhǔn)點失敗且必須被屏蔽，定量范圍就截斷到下一個最低的校準(zhǔn)點。在這種情況下，LQC仍必須由可接受的校準(zhǔn)樣品包含在內(nèi)（bracketed），否則檢測失敗。如果是ULOQ失敗，曲線的上端向下移動到下一個可接受的校準(zhǔn)點，且必須包含在可接受的校準(zhǔn)樣品內(nèi)，否則檢測也同樣失敗。如果樣本的測定值低于LLOQ或高于ULOQ，則必須調(diào)整樣本的稀釋倍數(shù)，再重新分析該樣品，使其測定值落在定量范圍內(nèi)。
LBA校準(zhǔn)曲線可能容易隨時間發(fā)生校準(zhǔn)漂移。校準(zhǔn)曲線性能的漂移定義為由于參比標(biāo)準(zhǔn)品、分析試劑和其他測試組分的反應(yīng)性或結(jié)合特性的變化而導(dǎo)致的校準(zhǔn)偏移。這種變化可能會改變校準(zhǔn)曲線的斜率或其他性質(zhì)，最終導(dǎo)致樣本的濃度報告為過高或過低。同時，該方法的定量上限和下限，或樣本的稀釋線性，也可能發(fā)生變化。
可能導(dǎo)致校準(zhǔn)曲線性能漂移的因素包括但不限于：(a)新批次的混合基質(zhì)；(b)關(guān)鍵試劑特性（如純度、特異性和捕獲或檢測抗體的結(jié)合親和力）的變化；(c)含有蛋白質(zhì)或脂質(zhì)添加劑或載體的非關(guān)鍵試劑的性能變化；以及(d)對參比標(biāo)準(zhǔn)品配方的修改。應(yīng)在方法開發(fā)的早期就開始監(jiān)測校準(zhǔn)曲線的性能，并在研究前驗證和樣本分析階段繼續(xù)進(jìn)行。此外，在多個臨床研究的時間跨度上，跟蹤校準(zhǔn)漂移是至關(guān)重要的。但是，目前還沒有用于監(jiān)測校準(zhǔn)曲線性能的共識或已經(jīng)建立的方法。
監(jiān)測校準(zhǔn)曲線漂移的建議包括:
旨在確定藥物濃度以支持藥代動力學(xué)研究的，高質(zhì)量和可靠的配體結(jié)合測試方法（LBA）在生物藥的開發(fā)過程中起著至關(guān)重要的作用。在典型的LBA方法中，使用校準(zhǔn)曲線通過內(nèi)插值（interpolate）測定質(zhì)量控制樣品和未知樣品中的藥物濃度。對大多數(shù)LBA方法，預(yù)計測試信號與藥物濃度的關(guān)系是非線性的。因此，建議應(yīng)用多參數(shù)，通常為4或5參數(shù)Logistic regression (4PL或5PL)的數(shù)學(xué)方法，在定量范圍內(nèi)，擬合至少6個校準(zhǔn)樣品的數(shù)據(jù)點以獲得校準(zhǔn)曲線。可考慮使用其他校準(zhǔn)樣品（包括零點或其他錨定點）來提高曲線擬合的質(zhì)量。
應(yīng)根據(jù)對準(zhǔn)確度曲線（accuracy profile）的分析，選擇最適當(dāng)和最簡單的回歸模型（可能應(yīng)用加權(quán)因子，weighting factor）的相關(guān)回歸分析的軟件，作為實驗室信息管理系統(tǒng)的一部分，或作為儀器數(shù)據(jù)分析包的一部分，或作為獨立軟件包都可以提供這樣的數(shù)據(jù)分析。校準(zhǔn)曲線的質(zhì)量以及最終測試結(jié)果的質(zhì)量高度地依賴于校準(zhǔn)樣品的制備過程、所使用的樣本基質(zhì)的類型以及校準(zhǔn)樣品的儲存條件。FDA、EMA、MHLW和ANVISA發(fā)布的機構(gòu)指南在不同程度上討論了校準(zhǔn)曲線參數(shù)及其性能要求，其中許多要求是相互一致的，但也存在一些差異。
本文旨在描述進(jìn)行回歸模型選擇、校準(zhǔn)曲線設(shè)計和數(shù)據(jù)分析的方法，主要目的是幫助讀者開發(fā)高質(zhì)量的生物藥定量分析方法，以支持非臨床和臨床藥代動力學(xué)研究。文中花了較大的筆墨詳細(xì)討論的一個重要內(nèi)容是與編輯校準(zhǔn)曲線的規(guī)范和適當(dāng)規(guī)則有關(guān)。同時提供了對于編輯校準(zhǔn)曲線的建議，這些建議遵循科學(xué)上健全，同時也符合行業(yè)慣例的原則。當(dāng)然，其他方法也可以，如果其科學(xué)性和適用性被證明是可以接受的。
本文如有疏漏和誤讀相關(guān)指南和數(shù)據(jù)的地方，請讀者評論和指正。所有引用的原始信息和資料均來自已經(jīng)發(fā)表學(xué)術(shù)期刊、官方網(wǎng)絡(luò)報道等公開渠道, 不涉及任何保密信息。參考文獻(xiàn)的選擇考慮到多樣化但也不可能完備。歡迎讀者提供有價值的文獻(xiàn)及其評估。
19.U.S. Food and Drug Administration, Title 21 of the U.S. Code of Federal Regulations: 21 CFR 11 “Electronic Records; Electronic Signatures”, Aug 2003.https://www.accessdata.fda.gov/scripts/cdrh/cfdocs/cfCFR/CFRSearch.cfm.
