上周，“袁來如此”專欄就PK LBA三個級別的方法驗證策略展開了詳細介紹（袁來如此｜大分子生物分析概論（三_上）：LBA定量方法驗證的策略），圍繞每個級別的驗證中應評估的參數(shù)、相應的接受標準進行分享，本期將延續(xù)上期內(nèi)容，繼續(xù)分享后續(xù)相關內(nèi)容。
文檔記錄是所有方法效能評估工作流程可重構性的一個重要組成部分。
對于監(jiān)管級驗證的方法，完整和及時的文檔記錄是建立方法有效性的必要條件。作為文檔記錄的核心內(nèi)容，標準操作規(guī)程(SOPs)將規(guī)定監(jiān)管級驗證，包括需要評估的方法參數(shù)、每個參數(shù)的接受標準以及特定于某個方法的驗證方案。編寫某個具體方法的SOP時，應便于該監(jiān)管級驗證后的方法在研究中樣本分析的應用，并且還需在每個研究階段結束時提交正式的分析結果報告。
對于科學級驗證的方法，其相關文檔記錄與監(jiān)管級驗證相比可以縮減，但必須確保在研究前驗證和研究中樣本分析階段生成的數(shù)據(jù)的完整性和有效性。在每個階段完成之后，操作者在報告或總結性文件中應當記錄每項評估的結果。
對于研究級驗證的工作流程，其相關文檔記錄與監(jiān)管級和科學級驗證相比可以進一步縮減，原因是使用研究級驗證的方法其生命周期較短，進行簡潔的文檔記錄即可。
監(jiān)管級：對于每個監(jiān)管級驗證，其相關SOP應當詳細介紹必須評估的方法參數(shù)、如何執(zhí)行每個參數(shù)的評估、每個參數(shù)的接受標準以及適當?shù)尿炞C文檔。此外，還應為每個方法準備一份正式的驗證方案，提供與方法實施相關的具體信息，包括分析程序的描述說明、關鍵試劑和非關鍵試劑的列表、支持該研究的科學家的列表、驗證標準操作程序的計劃偏差以及計劃偏差的理由。所有文檔都必須存放在安全的環(huán)境中。
科學級：應撰寫一份實施研究前驗證的計劃，預先記錄待評估的參數(shù)及其接受標準，且需要對每個不同的方法所定義的關鍵參數(shù)進行評估，以確保恰當?shù)貙嵤┭芯壳胺椒炞C。有時可能需要更寬泛的接受標準，可根據(jù)以下幾方面考慮：（1）項目的具體需要；（2）對方法開發(fā)過程中積累的數(shù)據(jù)進行科學評估；（3）如何利用研究中樣本分析數(shù)據(jù)。若相關參數(shù)和接受標準是在驗證之前作出，且在計劃中提供了理論依據(jù)和評估時，則也是可以接受的。或者可以撰寫一個專門描述需要評估的標準和科學級驗證接受標準的SOP作為上述驗證計劃的替代或補充。如果驗證實驗與SOP中定義的標準不完全一致時，那么在執(zhí)行支持科學級驗證的實驗之前，操作員應在驗證計劃中記錄該偏差和出現(xiàn)計劃偏差（planned deviation）的原因。
研究級：不需要正式的SOP或方案來執(zhí)行研究前驗證，但是建議預先確定好要評估的方法參數(shù)和接受標準，并記錄下來（在執(zhí)行的每個實驗的目的范圍內(nèi)）。
監(jiān)管級：對于監(jiān)管級驗證，在完成研究前驗證和驗證數(shù)據(jù)分析后，需提交正式報告，此驗證報告應包括執(zhí)行該分析方法的逐步說明，所有相關驗證數(shù)據(jù)存儲位置的列表以及驗證實驗中方法效能的評估。
在研究中樣本分析開始之前，須有一份詳細的SOP，概述如何使用該方法來確定未知測試樣品的濃度。此外，還須在SOP中約定闡明允許對研究樣本進行重復分析的標準、如何確定最終報告的結果以及有關重復分析的文檔記錄。
在研究中樣本分析階段結束時，分析人員須撰寫正式的生物分析報告詳細說明該方法的逐步執(zhí)行過程、提供用于分析的生物藥原液（drug stock）的信息、概述STD和QCs的效能、記錄失敗的分析運行和樣本的列表、記錄重新分析的樣本以及記錄對于驗證過的方法或方法SOP的偏離。
研究前監(jiān)管級方法驗證的數(shù)據(jù)和研究中真實樣本生物分析的數(shù)據(jù)的存檔應不晚于研究報告和生物分析報告定稿的時間。
科學級：對于科學級驗證，建議在完成研究前驗證和驗證數(shù)據(jù)分析后提交報告或總結文檔。該科學級驗證報告或總結文檔應包括方法的逐步執(zhí)行步驟、所有相關數(shù)據(jù)的存儲位置、驗證實驗中方法的效能、研究中樣本分析已確認的接受標準以及研究中樣本分析計劃（如適用，包括樣本稀釋方案、特定的分析程序、測試樣本驗收標準和允許樣本重復分析的原因）。如果上述所有內(nèi)容都簡明扼要地在總結文檔中列出，則無需再進行正式生物分析的方法SOP。
在研究中未知樣本分析的總結文件中，應參考科學級驗證的總結文檔。分析人員可提交一份研究報告，以記錄研究中樣本分析的執(zhí)行情況。此外，分析人員應發(fā)布一份生物分析報告，用于記錄該方法的效能、所有失敗的微孔板、微孔板/樣本失敗的原因以及樣本分析過程中發(fā)生的偏差。
研究前科學級方法驗證的數(shù)據(jù)和研究中樣本分析的數(shù)據(jù)存檔，應不晚于研究報告和生物分析報告的定稿時間。
研究級：對于研究級驗證方法，則不需要在研究前驗證執(zhí)行后提交正式報告，但應提供研究前方法效能評估的簡明文檔，包括方法的執(zhí)行步驟、相關的數(shù)據(jù)位置以及研究中樣本分析確定的接受標準。
總而言之，不建議為樣本分析制定正式的SOP，也不需要撰寫正式的研究報告，但分析結果應在實驗室記錄本或其他適用的數(shù)據(jù)存儲庫中清楚地匯總說明。
對于PK定量分析方法的驗證，即研究前和研究中方法的效能評估，采用上述三級式方法（第1級-監(jiān)管級驗證;第2級-科學級驗證;第3級-研究級驗證）不僅有利于生物分析業(yè)界，而且能通過實現(xiàn)更高效、更具成本效益的生物藥開發(fā)來使患者受益。
分析人員選擇適當?shù)姆椒ū碚?驗證級別，有助于戰(zhàn)略性地合理使用有限的資源，確保支持新藥發(fā)現(xiàn)或早期開發(fā)階段的研究得到有效執(zhí)行，具有一定的科學嚴謹性。
同時，還能高效產(chǎn)生關鍵決策所需的PK表征數(shù)據(jù)。當前制藥行業(yè)對不斷提高效率的要求正支持使用這種分級方式進行分析方法的效能評估。支持候選藥物的選擇或其它單次使用的方法的監(jiān)管級驗證表明，冗長的方法開發(fā)和驗證與方法的使用頻率或數(shù)據(jù)的預期應用并不匹配。
用于關鍵內(nèi)部決策的數(shù)據(jù)存在內(nèi)部時間敏感性，這也支持PK LBA方法驗證的分級式方法。因為開發(fā)和監(jiān)管驗證（根據(jù)監(jiān)管指南）這樣的LBA方法，對項目進展來說實際上是昂貴的時間和金錢成本，甚至還延遲了患者獲得新藥的時間。
生物基質(zhì)、測試試劑和藥物的可及性也限制了早期藥物的開發(fā)。越來越多的研究涉及稀有生物基質(zhì)的使用，而其可及性則限制了LBA方法的開發(fā)和驗證。此外，在藥物開發(fā)計劃的每個階段，是否能得到合適的試劑會限制方法效能評估的范圍，因為在藥物發(fā)現(xiàn)階段（新分子實體出現(xiàn)之前）通常沒有特異性試劑抗體（例如anti-idiotypic antibodies）。然而，即使存在這些限制，仍然需要通過可靠、科學合理的分析方法來產(chǎn)生準確的PK結果，以便做出明智的決策。
在水晶城第五次會議上，F(xiàn)DA的代表澄清說，針對非關鍵決策或內(nèi)部決策進行的研究將不受指南的約束，行業(yè)可以采取更加積極的方法平衡科學需求和監(jiān)管要求，同時確保得到的數(shù)據(jù)有助于有效的決策。這種觀點已經(jīng)被小分子生物分析專家們所接受，他們已經(jīng)開始討論并建議在PK評估中使用BMV分級驗證方法。小分子BMV和生物標志物評估倡導基于數(shù)據(jù)的用途來定制生物分析方法的開發(fā)和驗證，這獲得了一些監(jiān)管部門專家的支持。然而，大分子生物分析在分析平臺、基本方法論和大分子藥物的生化/生物物理特性等方面與小分子生物分析存在本質(zhì)上的不同，需要進行獨立考察。
對于大分子生物藥，LBA測試格式（以免疫測定的形式）是評估其PK特性的首選分析技術。定量分析生物基質(zhì)中的大分子濃度存在許多復雜性，必須考慮它們與內(nèi)源基質(zhì)成分的相互作用和測試格式對定量的影響。生物藥抗體的存在以及藥物與靶點的相互作用，可能會給大分子藥物的檢測和精確定量帶來問題。由于LBA方法有限的準確度和精密度以及使用非線性曲線擬合的必要性，使得大分子LBA方法無法采用與小分子LC-MS方法驗證相同的接受標準。
此外，在整個藥物開發(fā)過程中，對大分子藥物的表達系統(tǒng)或緩沖液配方所做的更改可能會改變藥物的結合作用和PK特性，因而不可能使用在前一個水平上經(jīng)過迭代而構建的小分子分級式驗證方式。由于這些差異，大分子生物分析方法性能的評估對于應用迭代的過程是有挑戰(zhàn)的。
在生物藥開發(fā)的整個生命周期中，可以使用不同級別的方法驗證。應當指出，每一個級別都應被視為完全獨立的方法評估。即使方法的試劑和測定步驟在研究級驗證和監(jiān)管級驗證之間沒有變化，也應分別在每個級別進行相應的方法驗證。評價方法的效能是否可接受的嚴謹性也隨著驗證級別的增加而增加。如果有必要，應當重新開發(fā)和驗證一個方法，以確保它符合必要的接受標準。但這并不是說，在不太嚴謹?shù)募墑e使用該方法獲得的經(jīng)驗不能應用于更嚴謹級別的方法開發(fā)上，而是不應簡單地將附加參數(shù)添加到較低級別的評估中，因為偏差和%CV的接受標準可能更嚴格，對相關文檔記錄和期望的流程可重構性的要求也會增加。
對大分子方法效能的評估，即驗證級別的選擇，應當強調(diào)是一個通過基于可接受風險水平的決策。這些風險水平針對每種情況，例如在藥物分子、分析方法、生物基質(zhì)和物種水平上的風險進行特別的評估。最近，F(xiàn)DA在其指南草案中暗示分析人員使用更靈活的驗證工作流程，指出：“對于需要監(jiān)管機構的行動才能獲得批準的，或者與藥物標簽（labeling）相關的關鍵研究，如生物等效性（BE）或PK研究，應完整地驗證生物分析方法。對用于制藥廠商內(nèi)部決策的探索性方法，較少的驗證可能就足夠了”。在指南草案中，F(xiàn)DA還進一步澄清說，“本指南也適用于非臨床藥理學/毒理學研究的生物分析方法”。適當?shù)姆治龇椒ū碚骱万炞C級別對于數(shù)據(jù)的預期用途應該科學合理，如果對選定適當?shù)募墑e有任何疑問，則默認應該進行更嚴格的評估，或者最終進行監(jiān)管級驗證。
對于向監(jiān)管部門提交的申報文件中的數(shù)據(jù)，如果數(shù)據(jù)可能對患者安全產(chǎn)生很大影響，或者這些數(shù)據(jù)是用于證明療效（例如GLP非臨床藥理學/毒理學研究、支持劑量選擇或標簽聲明的研究、在疾病適應癥人群進行的臨床I期研究），則需要對相關分析方法進行監(jiān)管級驗證（第1級，Tier 1）。對于非關鍵性研究（例如非GLP、在健康志愿者中進行的臨床I期研究，如單次上升劑量（SAD）或多次上升劑量（MAD）研究時，當PK不是研究的主要或次要終點時、概念驗證研究時），可以應用科學級驗證（第2級，Tier 2）。
此外，當PK將作為GLP非臨床或臨床研究的一部分，在稀有的生物基質(zhì)（例如，精液、關節(jié)腔滑液、誘導痰、口腔內(nèi)拭紙、組織均質(zhì)、支氣管肺泡灌洗[BAL]液、尿液等）中進行評估時，可以使用科學級驗證的分析方法（第2級，Tier 2），如FDA指南草案中說明的，本指南可能適用于血液和尿液的BA、BE和PK研究。對于用于內(nèi)部決策（例如探索性研究、候選藥物的選擇、配方比較或對藥理機制的研究）或作為非GLP 或藥物發(fā)現(xiàn)研究中使用了稀有基質(zhì)的PK評估，可以應用研究級驗證工作流（第3級，Tier 3）。圖1概述了在藥物開發(fā)的各個階段，可以應用于各個階段的相應級別的方法驗證流程。
應該在方法開發(fā)階段開始之前決定對該方法進行哪一級的驗證，并基于上述優(yōu)先標準作出決定，有助于開發(fā)符合其用途的方法，并防止“過度開發(fā)”僅需要研究級驗證的方法，或防止重新開發(fā)一個需要監(jiān)管級驗證的方法來使其更加穩(wěn)健或有更少的干擾，因為這兩種情況都將可能耗費更多的資源和時間。如果對如何使用給定方法生成的數(shù)據(jù)有疑問，或者對某個藥物開發(fā)項目進行不太嚴格的分析方法驗證存在固有風險，則最好默認為選擇更嚴格的驗證級別。圖2提供了一個示例決策樹，以幫助選擇適當?shù)尿炞C級別。
本文提出的分級方法驗證模式，通過對分析方法進行不同級別的驗證，目的是在已確立的監(jiān)管指南范圍之外，提供適合其目標生物分析數(shù)據(jù)的質(zhì)量保證。本文為實施這種分級方式提供了一個切實可行的理論框架，并提出了預先選擇適當驗證級別的理由。這種方式基于合理的科學原理，并且在每一個項目上對不同級別的驗證所伴隨的風險進行獨立的評估。建議各新藥開發(fā)商針對各自獨特的藥物開發(fā)項目和情況，對分析方法效能的驗證級別作出合理選擇。
筆者認為可以初步劃分監(jiān)管級、科學級和研究級驗證的適用范圍如下（供討論，與上文中一些建議和圖表并不完全一致）。另外不同的藥物開發(fā)商可以采用類似但并非完全一致的策略，特別是在科學級驗證和研究級驗證上：
1. 監(jiān)管級驗證：所有研究結果和數(shù)據(jù)必須納入向監(jiān)管機構提供的申報/注冊文件，包括非臨床GLP安全性研究、臨床I期PK/PD研究、人體生物等效性研究、臨床II/III期的關鍵PK或PD研究、藥物標簽（labeling）相關的研究等。
2. 科學級驗證：研究結果和數(shù)據(jù)一般不會納入向監(jiān)管機構提供的文件中，除非監(jiān)管機構有特別要求，有臨床前non-GLP試點PK/PD研究（non-GLP pilot PK/PD/Tox studies in Tox animal species）、動物生物利用度研究、其它非關鍵性研究如制劑優(yōu)化和候選藥物的選擇等。
3. 研究級驗證：研究結果和數(shù)據(jù)僅供藥物開發(fā)商內(nèi)部使用，如首次動物PK/PD研究、候選藥物的選擇等。
4. 特別聲明
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